A validação deve garantir, através de estudos experimentais, que o método atenda às exigências das aplicações analíticas, assegurando a confiabilidade dos resultados. Para tanto, deve apresentar precisão, exatidão, linearidade, sensibilidade e especificidade adequados à análise. Desse modo, é importante ressaltar que todos os equipamentos e materiais devem apresentar-se devidamente calibrados e os analistas dever ser qualificados e adequadamente treinados.
Deve-se utilizar padrões farmacopéicos. Serão admitidos estudos utilizando padrões secundários desde que seja comprovada sua certificação.
Para os estudos de biodisponibilidade e bioequivalência deve-se utilizar padrão interno, sempre que métodos cromatográficos forem utilizados. Deve-se justificar a impossibilidade de sua utilização.
Precisão
A repetibilidade do método é verificada através de, no mínimo, 9 (nove) determinações contemplando o limite de variação do procedimento ou seja, 3 (três) concentrações, baixa, média e alta, com 3 (três) réplicas cada ou por 6 (seis) determinações considerando-se a concentração média correspondente a 100% do esperado.
A precisão deve ser determinada em um mesmo dia (precisão intra-dia) e em dias diferentes (precisão inter-dias).
Precisão = CV% = desvio padrão
concentração média determinada
Pode ser expressa como desvio padrão relativo ou coeficiente de variação (CV%), não se admitindo valores superiores a 15%.,
Exatidão
A exatidão do método deve ser determinada após o estabelecimento da linearidade, limite de variação e da especificidade do mesmo, sendo verificada através de, no mínimo, 9 (nove) determinações contemplando o limite de variação do procedimento ou seja, 3 (três) concentrações, baixa, média e alta, com 3 (três) réplicas cada . Os ensaios devem ser realizados um mesmo dia (exatidão intra-dia) e em dias diferentes (exatidão inter-dias).
A exatidão é expressa pela relação entre a concentração média determinada experimentalmente e a concentração teórica correspondente.
Exatidão = concentração média experimental x 100%
concentração teórica
Curva de Calibração/Linearidade
Recomenda-se que sua determinação seja realizada através da análise de amostras extraída da matriz apropriada, no mínimo, 5 (cinco) concentrações diferentes. Procedimentos alternativos devem ser justificados.
Quando houver linearidade, os resultados devem ser analisados por métodos estatísticos apropriados como, por exemplo, o cálculo de regressão linear pelo método dos mínimos quadrados. Deve-se apresentar as curvas obtidas (experimental e a resultante do tratamento matemático), o coeficiente de correlação linear e o intercepto da reta.
Intervalos das curvas de calibração
O intervalo da curva de calibração deriva do estudo de linearidade do método e depende do objetivo de sua aplicação. As amostras analisadas dentro do intervalo da curva de calibração devem apresentar linearidade, exatidão e precisão compatíveis.
Especificações mínimas para a curva de calibração:
Análise de fármacos e medicamentos: 80 - 120% da concentração teórica.
Uniformidade de conteúdo: 70 - 130% da concentração teórica.
Teste de dissolução: ± 20% além do intervalo especificado.
Determinação de impurezas: do nível de impureza esperado até 120% do limite máximo especificado . Quando apresentarem importância toxicológica ou efeitos farmacológicos inesperados, os limites de quantificação e detecção devem ser adequados às quantidades de impurezas a serem controladas.
Especificidade/seletividade
Nos estudos de especificidade de métodos para determinação do teor do fármaco, procede-se analisando-se solução padrão do mesmo, em presença de quantidades conhecidas de possíveis interferentes (impurezas/excipientes/produtos de degradação), demonstrando-se que os resultados não são afetados pela presença de tais componentes. Para tanto, compara-se os resultados com aqueles obtidos a partir do ensaio de soluções semelhantes isentas do fármaco. Para testes de determinação de impurezas deve-se demonstrar, também, a separação individual dos interferentes relevantes.
Na ausência de padrão do produto de degradação, sub-produto ou impureza, a especificidade do método pode ser determinada comparando-se os resultados de análise das amostras contendo tais componentes com os resultados de análise das mesmas amostras utilizando-se outro método bem caracterizado e validado. Quando apropriado, nestes casos, deve-se submeter as amostras a condições de estresse: luz, calor, umidade, hidrólise e oxidação.
Limite de quantificação (LQ)
Estabelecido através da análise de soluções contendo concentrações decrescentes do fármaco até o menor nível determinável com precisão e exatidão aceitáveis. Pode ser expresso pela equação:
LQ = DP X 10
ic
onde: DP = desvio padrão do intercepto com o eixo do Y de várias curvas de calibração construídas contendo concentrações do fármaco próximas ao suposto limite de quantificação. O desvio padrão pode ainda ser obtido a partir da análise de um apropriado número de amostras do branco; ic = inclinação da curva de calibração.
Pode-se, também, utilizar a razão de 5:1 entre o sinal e o ruído da linha de base, devendo-se especificar o método utilizado para determinação do LQ.
Limite de detecção (LD)
Estabelecido através da análise de soluções de concentrações conhecidas e decrescentes do fármaco, até o menor nível detectável. Recomenda-se que o LD seja de 2 a 3 vezes superior ao ruído da linha de base. Pode ser expresso pela equação:
LD = DP X 3,3
ic
onde: DP = desvio padrão do intercepto com o eixo do Y de várias curvas de calibração construídas contendo concentrações do fármaco próximas ao suposto limite de quantificação. O desvio padrão pode ainda ser obtido a partir da análise de um apropriado número de amostras do branco; ic = inclinação da curva de calibração.
Robustez
A avaliação da robustez deve ser considerada durante a fase de desenvolvimento do método. Constatando-se suscetibilidade a variações nas condições analíticas, estas deverão ser adequadamente controladas ou precauções devem ser incluídas no procedimento.
Exemplo de variações:
- Estabilidade das soluções analíticas
- Tempo de extração
Variações típicas em cromatografia líquida:
- Influência da variação de pH da fase móvel
- Influência da variação da composição da fase móvel
- Diferentes colunas (diferentes lotes e/ou fabricantes)
- Temperatura
- Velocidade de fluxo
Variações típicas em cromatografia gasosa:
- Diferentes colunas (diferentes lotes e/ou fabricantes)
- Temperatura
- Velocidade de fluxo
Considerações específicas relevantes aos estudos de estabilidade
O método analítico empregado deve ser indicador de estabilidade, demonstrando especificidade e sensibilidade para os produtos de degradação eventualmente formados não sendo, necessariamente, o mesmo empregado no teste de determinação do teor.
O método analítico para realização do estudo de estabilidade deverá ser validado observando os parâmetros de exatidão, precisão, linearidade, limite de detecção, limite de quantificação, especificidade, limite de variação e robustez. Esta validação deverá ser realizada em presença dos sub-produtos e/ou produtos de degradação. Na ausência de padrões, deve-se submeter as amostras a condições de estresse: luz, calor, umidade, hidrólise e oxidação.
Considerações específicas relevantes para métodos bioanalíticos
Validação pré-estudo
Especificidade
Analisar amostras da matriz biológica (sangue, plasma, soro, urina, ou outra) obtidas de seis indivíduos, sendo quatro amostras normais, uma lipêmica e uma hemolisada, sob condições controladas referentes ao tempo, alimentação e outros fatores importantes para o estudo. Cada amostra branco deve ser testada utilizando o procedimento e as condições cromatográficas e espectrofotométricas propostas. Os resultados devem ser comparados com aqueles obtidos com solução aquosa do analito, em concentração próxima ao LQ.
Qualquer amostra branco que apresentar interferência significativa no tempo de retenção do fármaco, metabólito ou padrão interno, deve ser rejeitada. Caso uma ou mais das amostras analisadas apresentarem tal interferência, novas amostras de outros seis indivíduos devem ser testadas. Caso uma ou mais das amostras deste grupo apresentarem interferência significativa no tempo de retenção do fármaco, o método deve ser alterado visando eliminá-la.
Os interferentes podem ser componentes da matriz biológica, metabólitos, produtos de decomposição e medicamentos utilizados concomitantemente ao estudo. A interferência da nicotina, cafeína, produtos de venda isenta de prescrição e metabólitos deve ser considerada sempre que necessário.
Caso o método seja destinado à quantificação de mais de um fármaco, cada um deve ser injetado separadamente para determinar os tempos de retenção individuais e assegurar que impurezas de um fármaco não interfiram na análise do outro.
Curva de calibração/linearidade
Deve-se construir uma curva de calibração para cada fármaco utilizando-se mesma matriz biológica proposta para o estudo. A curva de calibração deve incluir a análise da amostra branco (matriz biológica isenta de padrão do fármaco e do padrão interno), da amostra zero (matriz biológica mais o padrão interno) e de cinco a oito amostras contendo padrão do fármaco e padrão interno, contemplando o limite de variação esperado (80% da concentração mais baixa e 120% da concentração mais alta que se pretende analisar), inclusive o LQ.
Fatores a serem considerados na avaliação da curva de calibração:
Desvio menor ou igual a 20% (vinte por cento) em relação a concentração nominal para o LQ
Desvio menor ou igual a 15 % (quinze por cento) em relação à concentração nominal para as outras concentrações da curva de calibração.
No mínimo quatro de seis concentrações da curva de calibração devem cumprir com os critérios anteriores, incluindo o LQ e a maior concentração da curva de calibração.
O coeficiente de correlação linear deve ser igual ou superior a 0,95.
Limite de quantificação
Nenhuma interferência significativa deve ser apresentada pela amostra branco no tempo de retenção do fármaco. O LQ deve ser no mínimo cinco vezes superior a qualquer interferência da amostra branco no tempo de retenção do fármaco.
O pico de resposta do fármaco no LQ deve ser identificável e reprodutível com precisão de 20% (vinte por cento) e exatidão de 80 (oitenta por cento)-120% (cento e vinte por cento).
Precisão
Recomenda-se, no mínimo, a análise de três concentrações (baixa, média e alta) dentro da faixa de limite esperado, realizando-se pelo menos cinco réplicas. O CV não deve exceder 15% (quinze por cento), exceto para o LQ, para o qual se admite valores menores ou igual a 20% (vinte por cento). Deve-se realizar análises em um único dia e em vários dias (ensaios intra-dia e inter-dias.
Exatidão
Determina-se pela análise de amostras contendo quantidades conhecidas de fármaco, em de três concentrações (baixa, média e alta) dentro da faixa de limite esperado, realizando-se pelo menos cinco réplicas. O desvio não deve exceder 15% (quinze por cento), exceto para o LQ, para o qual se admite valores menores ou iguais a 20% (vinte por cento). As análises devem ser realizadas em um único dia e em vários dias.
Recuperação
A recuperação mede a eficiência do procedimento de extração de um método analítico dentro de um limite de variação. Porcentagens de recuperação próximas a 100% são desejáveis, porém, admite-se valores menores, por exemplo, de 50 a 60%, desde que a recuperação seja precisa e exata. Este teste deve ser realizado comparando-se os resultados analíticos de amostras extraídas a partir de três concentrações (baixa, média e alta) com os resultados obtidos com soluções padrão não extraídas, que representam 100% de recuperação.
Controle de qualidade (CQ)
CQ do limite de quantificação (CQ-LQ): mesma concentração de LQ
CQ de baixa concentração (CQB): menor ou igual 3 x LQ
CQ de média concentração (CQM): aproximadamente a média entre CQB e CQA
CQ de alta concentração (CQA): 75 a 90% da maior concentração da curva de calibração
Critérios de aceitação
O método analítico é considerado validado quando cumpre com os seguintes critérios:
Precisão: os CVs calculados a partir de matrizes biológicas obtidas no mínimo, de três indivíduos, para CQB, CQM e CQA devem ser menores ou iguais a 15%, e menores ou iguais a 20% para CQ-LQ.
Exatidão: deve apresentar valores compreendidos dentro de mais ou menos 15% do valor nominal para CQB, CQM e CQA, e de mais ou menos 20% para CQ-LQ, calculados a partir de matrizes biológicas obtidas de, no mínimo, três indivíduos.
Sensibilidade: a menor concentração da curva de calibração pode ser aceita como o LQ do método quando o CV para CQ-LQ, calculado a partir de matrizes biológicas obtidas de, no mínimo, três indivíduos, for inferior ou igual a 20%.
Especificidade: a resposta de picos interferentes no tempo de retenção do fármaco deve ser inferior a 20% da resposta do LQ. A resposta de picos interferentes no tempo de retenção do fármaco e do padrão interno devem ser inferiores, respectivamente, a 20% e 5% da resposta na concentração utilizada.
Com o método analítico validado, sua precisão e exatidão devem ser monitoradas continuamente para assegurar desempenho satisfatório. Para atingir este objetivo, seis amostras de controle de qualidade (duas CQB, duas CQM e duas CQA) devem ser analisadas, juntamente com as demais amostras, a intervalos adequados, dependendo do número total de amostras. Os resultados das amostras do CQ servirão de base para aceitação ou rejeição da corrida analítica. No mínimo, quatro de seis amostras de CQ podem apresentar desvio de mais ou menos 20% do seu respectivo valor nominal. Duas de seis amostras de CQ podem estar fora destes limites, mas não para a mesma concentração.
Fonte: Anvisa
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